慢病毒包装

实验原理

慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒（HIV-1）。HIV-1直径约120nm，含两条正链RNA，可有效的进入细胞核中，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。以HIV-1为基础进行慢病毒载体改造，去除其致病基因，减少辅助质粒与载体质粒的同源性，使改造后的慢病毒滴度、生物安全性和外源基因表达效率显著提高。慢病毒可以将外源基因整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

慢病毒可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，是神经、心血管、肝脏、肌肉、眼、肺、肿瘤及其他科研领域常用的基因调控工具。

图1 慢病毒结构示意图

慢病毒的优势

1. 表达时间长：慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长时间稳定的表达，不随着细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选。

2. 安全性高：未发现致病性，已被用于CAR-T治疗作用于人体。

3. 免疫原性低： 直接注射活体组织不易造成免疫反应。

慢病毒包装服务类型

1. 过表达慢病毒：根据客户提供的基因信息，合成目的基因的cDNA序列，并将其连接到慢病毒载体上，通过包装获得目的基因的过表达慢病毒。

2. “三保一”干扰慢病毒：根据客户提供的基因信息，设计和合成3条针对目的基因的shRNA模板，并将其分别连接到慢病毒载体上，通过包装获得3个干扰目的基因的慢病毒株，以此达到确保至少1条能够达到有效干扰目的基因表达的目的。包装完成后提供给客户全部3种干扰慢病毒。

3. 定制靶点干扰慢病毒：根据客户提供的基因信息和确定的干扰序列，设计和合成1条针对干扰序列的shRNA模板，并将其连接到慢病毒载体上，通过包装获得目的基因的干扰慢病毒株。

慢病毒包装服务流程

1. 过表达慢病毒包装服务流程

2、干扰慢病毒包装服务流程

常用载体展示

过表达慢病毒载体

干扰慢病毒载体

慢病毒应用案例

1. 慢病毒感染细胞案例：Regeneration of cardiotoxin-injected muscle is impaired by AKAP6 shRNA lentivirus. From: AKAP6 inhibition impairs myoblast differentiation and muscle regeneration: Positive loop between AKAP6 and myogenin.

绿色荧光：慢病毒载体携带的GFP；蓝色荧光：DAPI

2. 注射慢病毒感染动物案例：TRAF2 protects against cerebral ischemiainduced brain injury by suppressing necroptosis.

         上图中WB胶图表明在对实验鼠脑区注射TRAF2 KD（敲除）慢病毒后，TRAF2的表达量显著下降，由于TRAF2的缺失，TRAF2 KD组的脑切片TTC染色表现出大面积缺血损伤症状（白色区域），PI凋亡检测结果显示TRAF2 KD模型组实验鼠脑神经元细胞凋亡显著高于其他实验组。

交付内容

需确认的信息

1. 目的基因信息。

2. 目的细胞信息。

3. 是否携带标签，如GFP、RFP、Puro等。

其他注意事项

1. 慢病毒的储存：短时间内使用可将慢病毒暂时放置于4℃保存（请尽量在三天内用完），如需长期保存需放置于-80℃。可储存6个月以上，但如果病毒存储时间超过6个月，在使用前需重新滴定病毒滴度。

2. 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%，因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融建议按照每次的使用量对病毒进行分装。

TROUBLESHOOTING

常见问题 

Q：根据文献选择慢病毒感染效率应该没问题，为什么要做细胞感染预实验？

A：常见的慢病毒和腺病毒以感染谱广和效果高而著称，但是具体到不同细胞，他们对不同病毒类型的感染效率都是不一样的，甚至于不同实验室的相同名字的细胞对同种病毒的感染效率也是有可能不同的(因为细胞在不断传代之后，遗传背景已经发生了变化)。在没有判断该细胞的最佳感染病毒类型之前就贸然选择病毒是存在风险的，即使后续的细胞实验是客户自己完成，我们也需提醒客户规避可能的风险。

Q：什么是MOl值？如何进行MOl值摸索？

A：MOl（Muitiplicity Of Infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。选择合适的MOl值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞，比如293细胞，MOl=1时，95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低，MOl值可能达到200-300。我们建议通过比较不同MOl(比如0、1、5、10、50、100等)感染细胞的结果（注意摸索是否需要填加polybrene），选择适合的MOl进行实验：可以先将培养好的细胞接种至96孔板，然后用携带报告基因EGFP的阴性对照慢病毒，按照不同MOl值比例感染细胞，进行MOl值摸索。

Q：慢病毒使用的安全性如何？

A：慢病毒已经被全世界许多实验室应用，至今没有生物安全性出现问题的报道，但仍具有潜在的产生复制型慢病毒和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！所有操作均应尽量在生物安全2级实验室的安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用75%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。

Q：在慢性毒介导的稳转株构建实验中，慢病毒感染细胞后，整合入基因组中的位点有多少？

A ：慢病毒的整合和加入的病毒量有关，加入量很多如MOI值达到100时可以进行多位点整合，最多5-10个，注意表达量的高低和整合位点与其在染色体上的位置有关。质粒很可能是整合在转录活性不强的区域，而慢病毒的偏好性在转录活性非常强的区域。

Q：对于片段特别大的外源基因，载体构建和病毒包装是否存在困难？

A：基因超过2500bp，如果还要增加1300bp大小的IRES-GFP，则大小将超过3500bp。因此如果基因太大，可以考虑不要加IRES-GFP序。基因过长对于慢性毒载体的构建会造成一定的困难，如扩增产生点突变的几率增加，扩增酶切回收效率不高；另外基因过大，病毒包装效率过低可能导致病毒包装失败。

Q：订购到的慢病毒如何保存和使用？

A ：包装好的慢病毒液全程采用干冰运输，快递至客户处。请务必注意查收，收到后请打开包装检查干冰是否还有剩余，病毒种类和规格是否发货单完全一致。请将慢病毒液在-80摄氏度保持，避免反复冻融，6个月内滴度不会明显下降，建议尽快使用完毕。对于保持6-12个月以上的样品，实验前需重新测定滴度。使用前从-80摄氏度冰箱取出病毒，置冰上融解，待用。一次用不完的病毒液可以放在4摄氏度冰箱中，一周内使用完毕。

Q：慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的区别有哪些？

A：慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的区别见下图。

Q：可以对miRNA的成熟序列进行慢病毒包装工作吗？

A：可以，请提供miRNA的成熟序列的序列信息即可。我们将进行miRNA过表达慢病毒载体的构建、包装、滴度检测及miRNA的qPCR检测。