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腺病毒包装

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腺病毒包装

腺病毒是一种线性双链DNA无包膜病毒,对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力,且具有嗜上皮细胞性。重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体,它可通过受体介导的内吞作用进入细胞内,但腺病毒基因组不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒作为一种常用的基因操作工具,在心血管、肝脏、肌肉、肺、肿瘤及其他领域广泛应用。

腺病毒(Adenovirus)是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒(见下图),可迅速感染分裂和非分裂期细胞,与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞,在细胞核孔附近聚集,并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造,保留包装信号序列,去除病毒蛋白的编码序列,不仅增加外源基因的装载容量,而且降低细胞毒性和机体免疫反应,从而获得安全性更高的基因导入系统。

腺病毒包装系统的特点:不整合到宿主细胞基因组、无插入致突变性、可进行有效扩增、获得高滴度高纯度的腺病毒。

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腺病毒结构示意


腺病毒的优势

1. 是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统:腺病毒感染细胞后,1-2天即可表达,是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统。

2. 滴度高:腺病毒系统在转有E1基因的HEK293细胞中可进行自我复制,可产生滴度为1010~1011PFU/mL的病毒。

3. 载体容量大:可容纳不超过5kb的片段。

4. 不整合到染色体中,无插入致突变性:腺病毒除卵细胞以外,几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应。


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腺病毒包装服务类型

1. 过表达腺病毒:根据客户提供的基因信息,合成目的基因的cDNA序列,并将其连接到腺病毒载体上,通过包装获得目的基因的过表达腺病毒。

2. “三保一”干扰腺病毒:根据客户提供的基因信息,设计和合成3条针对目的基因的shRNA模板,并将其分别连接到腺病毒载体上,通过包装获得3个干扰目的基因的腺病毒株,以此达到确保至少1条能够达到有效干扰目的         基因表达的目的。包装完成后提供给客户全部3种干扰腺病毒。

3. 定制靶点干扰腺病毒:根据客户提供的基因信息和确定的干扰序列,设计和合成1条针对干扰序列的shRNA模板,并将其连接到腺病毒载体上,通过包装获得目的基因的干扰腺病毒株。


腺病毒包装服务流程

1. 过表达腺病毒包装服务流程


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2、干扰腺病毒包装服务流程


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常用载体展示

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过表达腺病毒载体


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干扰腺病毒载体


腺病毒应用案例

1. 腺病毒感染细胞案例:Effects of small interfering RNA inhibit Class I phosphoinositide 3-kinase on human gastric cancer cells


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上图A-D为使用带有GFP标签的腺病毒感染后的SGC7901细胞,E-G为使用带有GFP标签的腺病毒感染后的SGC7901细胞


2. 注射腺病毒感染动物案例:Gene transfer establishes primacy of striated vs. smooth muscle sarcoglycan complex inlimb-girdle muscular dystrophy.


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本案例中,在研究肢节型肌营养不良症时,将基因调控腺病毒直接注射于实验鼠模型的皮下骨骼肌中,造成了β-SG的过表达,通过对多种指标的检测以及与对照的对比,得出相关结论。


交付内容


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需确认的信息

1. 目的基因信息。

2. 目的细胞信息。

3. 是否携带标签,如GFP、RFP、Puro等。


其他注意事项

1. 腺病毒的储存:短时间内使用可将腺病毒暂时放置于4℃保存(请尽量在三天内用完),如需长期保存需放置于-80℃。可储存6个月以上,但如病毒存储时间超过6个月,在使用前需重新滴定病毒滴度;

2. 反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%,因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融建议按照每次的使用量对病毒进行分装。


TROUBLESHOOTING


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常见问题 

Q:客户提供RNAi靶点进行腺病毒包装要注意哪些要点?

A:客户提供的RNAi靶点序列,需明确该靶点在靶细胞的RNAi效率是否经过验证。如果是客户从文献中查询到的shRNA干扰靶点序列,其在靶细胞的干扰效率能否达到客户要求具备一定风险,建议可进行小量包装验证后再进行大量包装实验。若客户无法提供RNAi靶点,建议客户在我司进行RNAi靶点的设计和筛选工作,将筛选得到的最佳靶点进行腺病毒包装工作。


Q:腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?

A:有要求。一般基因长度超过3000bp的基因在载体重组过程中难度已经加大,且会影响腺病毒的出毒效率。


Q:腺病毒发货前进行哪些质检工作?

A:发货前我们会对腺病毒的滴度进行检测,严格按照客户的要求的滴度进行发货;对于过表达目的基因的腺病毒,我们会将其感染293细胞,qPCR检测过表达目的基因的表达丰度。


Q:腺病毒的单位VP、PFU和IU各是何含义?

A:VP:病毒颗粒数(viral particle),是具备感染能力和不具备感染能力的腺病毒颗粒的总量。

PFU:空斑形成单位(plaque formation unit),是有感染能力的腺病毒的总量,即腺病毒的活性单位。

IU:感染单位(infectious unit),是腺病毒活性单位,测定方法是TCID50法。


Q:订制的腺病毒产品接收后如何保存和使用?

A:我们采用干冰特快专递方式递送到客户手中。

客户收到后,应注意以下几点:

1. 确认泡沫塑料盒中的干冰仍有剩余,冰盒内保持低温。

2. 确认泡沫塑料盒内物品与发货样本清单一致,腺病毒产品包装完整,没有破碎、渗漏。

3. 公司提供分装好的腺病毒产品,短时间内不使用请冻存于 -80℃超低温冰箱中,半年内使用完毕。

4. 冻存于-80 ℃超低温冰箱中的腺病毒产品使用前取出后在室温下解冻,解冻后放在冰浴中,并尽快使用。如果解冻后的病毒暂时用不完,滴度足够高时4℃可保存1~2周。

5. 若每次用量很少,可对腺病毒进行分装。


Q:包装好的病毒在使用中要注意哪些安全性问题?

A:腺病毒的使用要求在生物安全标准2级(BL2)的实验室进行,操作人员穿工作服、戴口罩及一次性乳胶手套。操作时应在指定的区域内使用II级生物安全柜;操作时动作尽量轻柔,避免产生气溶胶和飞溅;含有腺病毒的废液和用具可用121℃高压灭菌30分钟;使用锐器(如注射器、刀片)时务必要小心。


Q:用于体内试验的腺病毒,是否要求纯化?

A:体内实验腺病毒纯化是很必要的:因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白(细胞毒素)、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内,会引起宿主强烈的免疫反应。另外,纯化的作用还可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中。


Q:可以更换特异性启动子后进行腺病毒包装吗?

A:可以。常规采用CMV启动子可以获得理想的表达,若需要采用特异性启动子进行腺病毒包装,建议验证该启动子介导的表达效率后,再进行腺病毒特异性启动子载体的构建及包装工作。


Q:慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的区别有哪些?

A:慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的区别见下图。


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