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腺相关病毒包装


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腺相关病毒包装

腺相关病毒( adeno-associated virus,AAV) 是一类细小病毒,基因组为单链DNA,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。重组腺相关病毒(recombinant AAV, rAAV)是利用AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体,可将目的基因的CDS区序列或者RNAi干扰序列插入rAAV表达质粒中,包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。在人类和小鼠中,AAV感染可以介导外源基因发生低频率(不高于2%)的定向整合,插入的位置一般在19 号染色体短臂(人类基因组中的AAV S1 和鼠中的ROSA26 位点)。病毒基因组在不发生整合的情况下在被感染细胞内形成伴随体。腺相关病毒广泛应用在神经、心血管、肝脏、肌肉、肺及其他领域,其主要的应用方向在于定位注射和整体注射。


腺相关病毒的优势

1. 表达时间长:绝大多数重组rAAV不会整合到基因组上,而是在宿主细胞中串联形成附加体(episome)存在于细胞核中,细胞在细胞复制和分裂后会丢失附加体,并因此失去基因表达能力,rAAV在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达6个月以上。

2. 扩散性强:rAAV的体积小,滴度高,因此具有远高于腺病毒和慢病毒的扩散性,可以穿透血脑屏障,是理想的神经元和胶质细胞感染工具。

3. 特异性强:rAAV有十数种常用的血清型,不同的血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力,是动物实验首选。

4. 安全性高:目前还没有发现AAV能对人体致病,是美国FDA批准的可以直接用于人体基因治疗的最安全的病毒载体。

5. 免疫原性低:当AAV用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时,不易造成免疫反应。

6. 高稳定性:rAAV病毒在4℃可以保存1周,并且对氯仿等试剂具有抗性。


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腺相关病毒包装服务类型

1. 过表达腺相关病毒:根据客户提供的基因信息,合成目的基因的cDNA序列,并将其连接到腺相关病毒载体上,通过包装获得目的基因的过表达腺相关病毒。

2. “三保一”干扰腺相关病毒:根据客户提供的基因信息,设计和合成3条针对目的基因的shRNA模板,并将其分别连接到腺相关病毒载体上,通过包装获得3个干扰目的基因的腺相关病毒株,以此达到确保至少1条能够达到有效干扰目的基因表达的目的。包装完成后提供给客户全部3种干扰腺相关病毒。

3. 定制靶点干扰腺相关病毒:根据客户提供的基因信息和确定的干扰序列,设计和合成1条针对干扰序列的shRNA模板,并将其连接到腺相关病毒载体上,通过包装获得目的基因的干扰腺相关病毒株。

4. 可根据病毒感染的靶细胞种类选择相应的血清型,各种血清型的特异性见下表。


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腺相关病毒包装服务流程

1. 过表达腺相关病毒包装服务流程

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2. 干扰腺相关病毒包装服务流程

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常用载体展示

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腺相关病毒载体展示


腺相关病毒应用案例

1. 腺相关病毒感染细胞案例:Cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) regulates the circadian clock.


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本案例中使用了携带GFP标签的AAV病毒感染SCN细胞,观察到了绿色荧光,感染效率较高。


2. 注射腺相关病毒感染动物案例:Akt Suppresses Retrograde Degeneration of Dopaminergic Axons by Inhibition of Macroautophagy.

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通过脑立体定位注射的方式,将AAV病毒原位注射至小鼠SN区域。由图中可以看出,在ATG 7缺失后,SNpc多巴胺神经元的轴突对逆行轴突变性具有抵抗力。


交付内容


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需确认的信息

1. 目的基因信息。

2. 目的细胞信息。

3. 是否携带标签,如GFP、RFP、Puro等。


其他注意事项

1. 腺相关病毒的储存:短时间内使用可将腺相关病毒暂时放置于4℃保存(请尽量在三天内用完),如需长期保存需放置于-80℃。可储存6个月以上,但如病毒存储时间超过6个月,在使用前需重新滴定病毒滴度;

2. 反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%,因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融建议按照每次的使用量对病毒进行分装。


腺相关病毒与慢病毒、腺病毒的区别


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