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详细内容

CRISPR_Cas9文库高通量筛选

简介

CRISPR/Cas9系统是当今基因编辑领域最热门的明星工具,2013年,Broad研究所的两个研究团队分别在Science杂志同一期上发表了CRISPR文库的相关研究。在此之后,基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速发展,CRISPRa,CRISPRi及CRISPR敲除文库已经广泛用于证明新的生物学机制,如耐药性和细胞存活信号。多篇CNS(Cell、Nature、Science)连续报道。利用该技术,研究人员在药物靶标发现、基因功能研究、药物敏感基因研究等领域取得了巨大的成功。


服务内容(以耐药基因为例)

临床问题提出,选定合适的研究目标,确定研究癌种与目标药物。

个性化设计,全基因组筛选可能与药物发挥协同作用的基因。

高通量测序及候选基因筛选。

候选基因功能验证:细胞水平、动物水平、临床相关性等。

5 数据库检索寻找候选增敏基因的小分子抑制剂,如有可进行成药性研究,验证药物协同作用

药理研究,尝试阐述药物协同作用机制。


一般筛选流程(耐药基因为例)

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筛选优点

✔ 快速准确的找到与某种表型相关的基因

✔ 靶点效率高

✔ 应用范围广

✔ 开发潜力大


案例

 药物靶标发现

Molecular CancerIf 7.776杂志8月份在线发表了广州市第一人民医院的文章,伊马替尼(格列卫)是一种治疗白血病及胃肠道间质肿瘤的药物,但往往产生耐药,机制不明。在该研究中,研究人员运用CRISPR/Cas9全基因敲除文库在胃间质瘤中筛选并验证了9个可能参与伊马替尼耐药的基因,可以用于深入探讨伊马替尼耐药的分子机制。

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引文:Cao J,Wei J,Yang P,et al. Genome-scale CRISPR Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromaltumor with Imatinib resistance. Molecular Cancer. 2018;17(1):121-127.


2018年4月份哈佛大学研究团队在Cell杂志发表了运用CRISPR激活文库筛选了化疗耐药相关的lncRNAs的研究论文。阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一种治疗AML的药物,但往往产生耐药,机制不明。作者利用CRISPR文库原理构建了同时筛选有功能的mRNA、lncRNA的sgRNA筛选技术,通过“随机激活lncRNA、mRNA的转录表达”的方式,筛选针对AML的阿糖胞苷耐药RNA。最后发现lncRNA GAS6-AS2的激活会介导耐药的产生。

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引文:Bester AC,Lee JD,Chavez A,et al. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell. 2018;173(3):649-664.


 自噬相关基因筛选

自噬是一种细胞内降解过程,需要多个自噬相关(ATG)基因的参与。在这个研究中,东京国立癌症中心研究所采用自噬流体报告基因GFP-LC3-RFP进行了全基因组CRISPR文库筛选,并鉴定出新的ATG家族基因TMEM41B,并发现TMEM41B与VMP1在自噬体形成的早期阶段一起发挥作用。

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引文:Morita K,Hama Y,Izume T,et al. Genome-wide CRISPR screen identifies TMEM41B as a gene required for autophagosome formation. J Cell Biol. 2018;217(11):3817-3828. 

 

 肺转移基因筛选

Cell杂志发表的张峰团队的研究论文,该研究采用“全基因组CRISPR敲除文库”,经过慢病毒库扩增后,感染肺癌细胞株,经筛选后接种到裸鼠皮下,定期观察直至其肺部生成足量转移灶,取肺组织并提取基因组DNA,通过PCR技术扩增sgRNA靶序列,高通量测序获得转移靶基因,并进行实验验证。

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引文:Chen S,Sanjana NE,Zheng K,et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.Cell. 2015; 160(6):1246-60.



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