循环肿瘤细胞检测在妇科恶性肿瘤中应用的研究进展

随着医疗技术的不断发展，越来越多的恶性肿瘤得以有效控制甚至治愈。然而，由于起病隐匿、早期无明显症状、容易复发及转移等因素，仍有很大一部分肿瘤患者预后较差，这对恶性肿瘤的早期诊断、预后监测提出了更高的要求。近年来，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测作为一种新型肿瘤诊断及监测手段而受到越来越多的关注。CTCs检测被称作“实时的液体活检”，即以微创便捷的方式达到了活检的目的，目前已被证实其计数的动态变化与多种实体肿瘤的疗效、复发、转移等具有一定相关性。

妇科恶性肿瘤是威胁广大妇女健康和生命的主要疾病，卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌是最常见的三大妇科恶性肿瘤，近年来发病呈逐年增加且年轻化的趋势。目前对于妇科肿瘤的诊断与监测手段主要有CA125、HE4、SCC等血清肿瘤标志物检测，超声、CT和MRI等影像学检查，以及脱落细胞、组织活检等病理学检查。近年来，随着循环肿瘤细胞检测技术的不断革新以及在其他实体肿瘤诊疗中应用研究的进展，国内外学者将研究范围逐渐拓宽至妇科肿瘤，并发现CTCs检测有望成为提高妇科肿瘤早期诊断率及诊断特异性、预测预后、指导个体化治疗的新手段。本文就CTCs检测与妇科恶性肿瘤的相关研究进行综述。

1、CTCs概述及检测方法

 CTCs是指从肿瘤原发灶、转移灶或其他不明部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的肿瘤细胞的统称。少数CTCs能逃避机体的免疫杀伤，随血流播散至远端器官后形成转移灶。因此，CTCs的出现被认为是恶性肿瘤血行转移的重要始发事件。上皮源性肿瘤CTCs的形成、迁移、侵袭与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）及间质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）密切相关。外周血循环肿瘤细胞还具有聚集成团的特性，由多个CTCs形成的结构称为循环肿瘤微栓（circulatingtumor microemboli，CTM），CTM比单个存在的CTC在存活和转移等方面更有优势，被广泛认为是肿瘤高度转移潜能的标志。

 外周血循环肿瘤细胞仅占外周血白细胞的1/107~1/106，且入血呈现不连续性并具有很强的异质性，因此CTCs的检测技术一直是研究的重点和难点，其中主要包括CTCs富集技术及鉴定技术。目前应用最广泛的CTCs富集方法是基于细胞表面标志富集法，其中获得美国食品和药品管理局（Foodand Drug Administration，FDA）认证的CellSearch检测系统在很多与癌症相关的临床研究中被作为金标准，该系统使用包被上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体的免疫磁珠对7.5mL外周血中的CTCs进行富集和计数。此外，还有基于CTCs密度、大小、电荷和可变形性等物理特性进行的各类富集方法。富集分离后的CTCs需进一步鉴定，目前采用RT-PCR、免疫荧光标记、RNA原位杂交、染色体核型鉴定等多种技术可对CTCs进行细胞形态学、免疫学、分子学等的检测鉴定，从而实现对外周血循环肿瘤细胞的定性及定量分析。

 其中，CTCs的分子学标志物检测是目前研究的一大热点。在妇科肿瘤方面，Kolostova等研究发现在浆液性卵巢癌患者外周血循环肿瘤细胞中最常见基因表型为上皮细胞黏附分子（EpCAM）、重组人细胞角蛋白-19（KRT19）及黏蛋白（MUC1），并指出CTCs细胞形态学的评估可以为提高检测的特异性提供十分有效的补充。Obermayr等通过对比卵巢癌患者的癌组织、外周血样本和健康者的外周血样本，发现11个CTCs标记候选基因，其中以亲环素C（cyclophilin C，PPIC）表达量最高，且化疗后铂耐药的患者比铂敏感的患者更能检测到PPIC阳性的CTCs。免疫组织化学分析表明，叶酸受体-α在82%卵巢癌及90%子宫内膜癌组织中呈现高表达，而在外周血中除了一些激活的单核细胞亚型会表达功能性叶酸受体外，没有其他的非恶性肿瘤细胞会表达功能性叶酸受体，这种差异可以用于区分CTCs和外周血单核细胞。O'Shannessy等使用ApoStream技术在转移性非小细胞肺癌、乳腺癌及卵巢癌中均检测到了叶酸受体-α阳性的循环肿瘤细胞，并指出叶酸受体-α阳性的CTCs检出为判断患者疗效、进行靶向治疗等提供了新的思路。由此可见，分子学标志物检测作为CTCs检测技术的进一步延伸对提高CTCs检测的准确度及特异性、提示肿瘤的发生发展及疗效具有一定作用，但目前仍缺乏大样本量的循证医学数据，需进一步实验探究来证实。

2、CTCs检测与其他实体肿瘤

 目前，已有许多研究证实CTCs检测在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌等多种实体肿瘤的诊疗中起到了辅助诊断、预测肿瘤进展及预后、评估疗效、指导个体化治疗方案等作用。如Cheng等检测了广泛期小细胞肺癌患者化疗前后CTCs计数的变化情况，研究结果显示CTCs计数的动态变化可反映广泛期小细胞肺癌患者预后情况。Si等的研究发现混合型及间叶型CTCs与鼻咽癌的转移密切相关，且CTCs计数的减少提示了鼻咽癌患者良好的治疗效果。Krebs等检测了48例行四联化疗的晚期结直肠癌患者外周血CTCs计数，结果显示高CTCs计数组行强化四联化疗后总生存期（OS）较非强化组明显延长，而低CTCs计数组行两种化疗方案后总生存期（OS）中位数无明显差异，研究者依据该结果得出设想：可根据外周血CTCs计数进行化疗方案的选择，以避免低CTCs计数患者采用过高毒性的化疗方案。

3、CTCs检测与卵巢癌 

卵巢癌是目前病死率最高的妇科恶性肿瘤，由于卵巢癌患者早期无明显临床症状，70%发现时已属晚期，且卵巢癌细胞对于放、化疗敏感性较差，据统计，我国卵巢癌患者年龄标准化5年生存率仍低于40%。同时，超过75%的患者在初诊时已有证据显示出现了卵巢外的转移，主要是腹膜转移，一旦发生了转移，卵巢癌患者的预后不良。可见发病隐匿、肿瘤的复发和转移是卵巢癌预后差的主要原因。近年来，有研究显示CTCs检测在上皮性卵巢癌的诊疗中有一定的临床应用价值，主要包括辅助早期诊断、对于晚期及复发性上皮性卵巢癌的预后判断及疗效评估等。

3.1 辅助诊断    

临床常用的卵巢癌诊断及监测方法包括血清CA125和HE4水平测定、超声检查、CT和MRI、组织活检等。近年来有研究发现CTCs检测与目前广泛应用于临床的各项检查手段相比具有微创、实时性、高特异性等优点，其动态检测结果可作为目前常用的诊断及监测手段的补充。Pearl等采用基于细胞表面标志富集法检测了129例上皮性卵巢癌患者术前外周血CTCs，以外周血CTCs计数＞5/mL为CTCs阳性标准。结果显示，CTCs检测在Ⅰ期及Ⅱ期上皮性卵巢癌中的敏感度为41.2%，特异度为95.1%，阳性预测值为77.8%，与血清CA125水平相比具有更高的敏感度及阳性预测值。故Pearl等指出CTCs检测可能使上皮性卵巢癌的早期发现成为可能。

3.2 预测进展及预后   

研究显示，CTCs的出现往往与不良的临床结局相关。Poveda等使用CellSearch检测系统对216例复发性卵巢癌化疗患者进行了CTCs检测，探讨CTCs数量与无进展生存时间（PFS）和生存时间（OS）的关系，单变量Cox回归分析显示外周血CTCs≥2/7.5mL的患者进展和死亡的风险分别是阴性患者的1.89和2.06倍；结合CA125水平、铂敏感性、病灶直径及数量、ECOG评分以及肿瘤分级等多因素进行分析，结果显示有CTCs水平升高的患者进展和死亡的风险分别是阴性患者的1.58和1.54倍。Romero-Laorden等对多个关于卵巢上皮性癌循环肿瘤细胞及微转移细胞的研究进行了系统回顾，结果显示，循环肿瘤细胞和微转移细胞的存在与不良的临床病理学特点以及不良的临床结局有关。

韩晓芳等采集了50例卵巢癌患者的外周血，应用密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子免疫磁珠富集法检测外周血中CTCs的数目，以7.5mL外周血中检出1个CTC为阳性标准，并比较其与患者临床特征之间的关系。研究结果显示，随着肿瘤的疾病发展，CTCs数量明显增加，且可以预测卵巢癌远处转移和复发。

然而，CTCs在预测卵巢癌进展及预后方面的作用尚存在争议。Liu等的研究发现CTCs计数呈现出随着时间的推移而显著下降的趋势，但CTCs计数的变化与初诊为卵巢癌和复发性卵巢癌患者的临床特征及临床结局均无显著相关性。

3.3 指导个体化治疗    

随着CTCs检测技术的不断革新，一些新的CTCs检测技术在判断耐药、指导治疗方案等方面的应用有了一定的进展。Kolostova等利用细胞大小分离法对进行规范治疗的卵巢癌患者行外周血CTCs动态检测（MetaCell技术），并对CTCs分子形态进行分析，研究发现，CTCs的分子形态学分析可能成为指导卵巢癌的个体化治疗的新方法。ERCC1是人体DNA的修复基因，其表达水平上升，可使铂化合物造成的DNA损伤得以修复。Kuhlmann等的研究表明，ERCC1基因阳性的CTCs可作为血液基础上预测初诊为卵巢癌患者铂类耐药的诊断学生物标记。梁秀婷等对28例接受化疗的卵巢癌患者化疗前后的外周血采用免疫磁珠微粒阴性富集进行CTCs检测，以外周血中CTCs≥2/3.2mL为阳性标准。研究结果显示，化疗前后CTCs变化与疗效有一定关系，CTCs可作为评估卵巢癌化疗疗效的参考指标。

4、CTCs检测与宫颈癌

 宫颈癌是目前发病率最高的妇科恶性肿瘤，由于宫颈防癌筛查的普及，越来越多的宫颈癌及癌前病变得以早期发现和治疗。然而，我国每年仍有2~3万女性死于宫颈癌，且宫颈癌的发病呈现出年轻化的趋势。早期诊断、制定合理的治疗方案、治疗后随诊是降低宫颈癌病死率的关键。目前有研究证实，CTCs检测可应用于宫颈癌转移风险的预测及化疗疗效评估中。

4.1 预测进展及预后   

Lee等对788例宫颈癌患者治疗前CTCs计数与鳞状上皮细胞癌抗原（SCC-Ag）水平进行了比较，结果显示，高外周血CTCs计数是局部晚期宫颈鳞状细胞癌患者预后差的独立预测因素，CTCs可能作为宫颈癌诊治中除SCC-Ag之外的另一个生物学标志物。Weismann等对子宫全切术后的宫颈癌患者外周血CTCs进行了E6/E7 HR-HPV致癌基因的检测，研究结果显示，表达E6/E7 HR-HPV致癌基因的CTCs可作为宫颈癌术后隐匿性转移阶段早期诊断的特异性基因标志，并可提示转移的高风险。

4.2 疗效评估    

Tewari等对进行化疗联合贝伐单抗治疗的240例晚期宫颈癌患者进行了治疗前及治疗后的外周血循环肿瘤细胞检测，探究CTCs与宫颈癌患者预后及生存率的关系。研究显示，治疗前患者外周血CTCs计数的中位数为7CTCs/8.5mL全血（范围0～18mL），在经过36d的治疗后CTCs计数的中位数下降至4CTCs/8.5mL全血（范围0～17mL）。

4.3 指导个体化治疗    

除了在预测预后中的作用，Weismann等的研究还提出表达E6/E7 HR-HPV致癌基因的CTCs检测可使宫颈癌的个体化治疗成为可能。

5、CTCs检测与子宫内膜癌 

子宫内膜癌的病死率位于妇科肿瘤的第二位，其中晚期子宫内膜癌因发生肿瘤侵袭及转移而预后较差。目前，仅有少量研究探讨了CTCs与子宫内膜癌之间的关系。Alonsoalconada等的研究发现，在高风险的子宫内膜癌患者外周血中可检测出CTCs，并在进一步的研究中发现，在ETV5基因高表达的子宫内膜癌细胞系中检测出了上皮间质转化（EMT）标志物，并在动物模型中证实这与CTCs的形成及转移倾向相关。此外，Bogani等也指出，在高风险的子宫内膜癌患者中CTCs的检出与子宫肌层浸润及淋巴结阳性有关。可见，CTCs与子宫内膜癌的发生发展有着密切关系，然而，CTCs检测在子宫内膜癌中的应用价值仍需更多的临床研究进一步证实。

6、讨论与展望

 循环肿瘤细胞检测目前尚未大规模应用于临床，尤其在妇科恶性肿瘤方面仍处于研究探索阶段。目前仍存在以下待解决的问题：

1 尚无多中心临床研究明确指出外周血CTCs检测与现有的妇科恶性肿瘤监测手段相比有更高的敏感度与特异度。

2 目前CTCs检测无统一的检测及鉴定方法、随访方案及阳性参考标准。

3 对于CTCs阳性或CTCs计数动态增加的恶性肿瘤患者，在影像学未发现明确复发或转移病灶时进行进一步治疗是否有提高生存率、改善预后的作用目前尚无定论。

4 CTCs检测费用高昂导致在随访中易造成失访。以上问题都在一定程度上限制了循环肿瘤细胞检测技术在临床中的运用。

另外，有研究发现，部分肿瘤患者外周血中存在含有肿瘤特异性的游离DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）片段，它是CTCs及坏死或凋亡的肿瘤细胞破裂释放至外周血的游离DNA，是一种敏感性和特异性都很高的肿瘤生物学标志物，其携带了肿瘤特异性突变片段，表现出与原发肿瘤组织相同的生物学特性。此外，还有研究表明，CTCs可发生干细胞化而转化为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），并与肿瘤的复发、转移、耐药等具有一定相关性。这些由循环肿瘤细胞检测衍生出的肿瘤标志物检测与循环肿瘤细胞检测一样都具有一定的临床应用价值，但目前仅能证实其存在于肿瘤复发及转移的相关性，而引起肿瘤复发的机制及相关信号通路等还有待于进一步探索。

通过对CTCs检测技术的革新及大样本多中心临床试验的开展，若能证实CTCs检测的高敏感度与高特异度、形成统一的方法论、提高检测效率、降低检测费用，CTCs检测在妇科肿瘤中的应用价值值得期待。此外，若循环肿瘤细胞检测与肿瘤细胞培养、肿瘤细胞靶向生物治疗等相结合，相信能为恶性肿瘤复发与转移的预测、预后判断、疗效评估、个体化治疗等带来更多的思路。