实时荧光定量PCR（q-PCR）

实时荧光定量PCR技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。qPCR是分子生物学研究和诊断中常用的技术手段。荧光定量PCR技术与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

常见问题

一、如何选择合适的内参基因？

常见物种做mRNA使用actin做内参，miRNA检测使用U6做内参，特殊物种根据文献选择合适的内参。对于一些无法确定内参的物种，我们可以提供内参基因筛选服务，选出稳定的内参用于后续实验。

二、引物出现非特异怎么解决？

提高退火温度；减少引物量；重新设计引物。

三、判断扩增曲线是否良好的指标有哪些？

1 曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。

2 曲线指数期斜率与扩增率成正比，斜率越大扩增效率越高。

3 标准的基线平直或者略微下降，无明显的上扬趋势。

4 各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。

四、荧光阈值

在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。

五、Ct值

在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。