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双荧光素酶报告基因检测

报告基因系统(Reporter Assay System)是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点。博艾迈迪森生物采用荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统。

报告基因(荧火虫荧光素酶)活力的改变,与基因表达的特定实验条件相关

而示踪基因(海肾荧光素酶)作为内对照,使测试不被实验条件变化所干扰,减少内在的变化因素所削弱的实验准确性

双荧光素酶报告系统一般还常用于 microRNA/lncRNA 的靶基因验证。


实验流程:


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影响因素及注意事项:

1 报告基因检测受多种因素影响(载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等) , 因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔,并且引入另一个报告基因作为内参。

2 细胞培养时间不宜过长,12-36 h内最好。长时间培养后, 细胞难裂解。

双荧光素酶报告基因的载体选择

        a.萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3pGL-4的载体或自己构建相应的载体

        b.海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL -4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子(如SV40、CMV ) , 而选用中等强度的启动子(如TK)。

4 双荧光素酶报告基因的载体比例:根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整(萤火虫载体与海肾载体比例分别用1 : 10、1 : 20、1: 50、1: 100),萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

5 最适反应温度:室温( 20-22℃)。各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温。

6 双荧光素酶反应体积: 20uL (细胞裂解产物)-100uL(萤火虫荧光素酶底物) -100ul(海肾荧光素酶底物),底物星可根据实际情况调整,但一定要保证底物过量,不然会造成检测结果出现大的偏差。

7 细胞裂解液无需离心去沉淀。







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