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重庆医药研发





详细内容

新西兰兔膝骨关节原代软骨细胞分离培养

实验动物

新西兰大白兔。


主要试剂

PBS、DMEM培养基、双抗、FBS、胰蛋白酶、II型胶原酶。


实验步骤

取材:如图所示找到软骨。


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细胞消化:将软骨块转移至10 ml离心管内。加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶置于37C恒温箱内消化,每15 min震荡一次,共消化30 min。取出离心管加入含15%血清培养基终止消化,以1200 r/min,离心5 min,弃上清。用含双抗的PBS液洗涤一遍,相同转速、时间离心,弃上清。加入0.3%II型胶原酶3ml,置379C恒温培养箱内消化45min,每15 min取出震荡一次,取出离心管加人同体积15%胎牛血清培养基终止消化,以1200 r/min,离心5 min,弃上清。加含双抗PBS混匀,使用100目不锈钢网筛过滤,所得滤液放入另一无菌离心管内,1200 r/min,离心5 min,弃上清,加少量含血清的培养基吹打放置。原过滤后的组织块重新置入离心管内,如前法消化45 min,消化后的处理同上。将两次消化所取的软骨细胞混合,台盼蓝染色检测细胞活性,血球计数板计数。


软骨细胞培养:

软骨细胞生长情况软骨细胞分离培养,观察细胞生长、形态、细胞密度等生物学形态拍照记录。按照CCK-8试剂盒说明,连续检测8d,分别用酶标仪检测在450nm处的吸光度( 0D值) ,绘制细胞生长曲线。

细胞活性检测分离培养的原代软骨细胞呈圆球形,悬浮状态,取9滴细胞悬液加入1滴0.4%台盼蓝,充分混匀,静置5~10 min,取1滴混合液,注人血细胞计数板,计算每毫升培养液内活细胞数,检测活细胞率约90%左右。


难点

取材要准,消化时间不宜过长。


细胞形态

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原代分离第六天的兔软骨细胞


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