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详细内容

Transwell迁移

原理

将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。Transwell迁移实验常用8.0、12.0 μm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。


实验流程

基质胶铺板用BD公司的Matrigel1 :8 (根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37*C30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液:制备细胞县液前可先让细胞撤血清饥饿12 -24h,进一步去除血清的影响(这一步并不是必须的)消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1- 2遍), 用含BSA的无血清培养基重息。调整细胞密度至5x105/mL。

接种细胞:取细胞县液100uL加口入Transwell小室;24孔板下室一般加入600μL的培养基;培养细胞:常规培养12-48h。

结果统计:直接计数法:贴壁细胞计数,这里所谓的贴壁是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。取出Tanswell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

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实验结果

完整实验报告一份,实验原始数据、图片、分析结果、实验流程等。


注意事项

特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别细心,且出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。


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