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详细内容

细胞生物学检测—MTT

原理

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4.5)-dimethylthiahiazo (-Z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化台物,是种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N.N-二甲基甲酰胺和

20%的十二甲基磺酸钠(pH=4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度0D值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。


实验步骤

1 接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积20uL。

2 细胞培养:同一般培养条件,培养3-5天。

3 呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液( 5mg/mL用PBS配)20uL。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于基浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150uL DMSO , 振荡10分钟使结晶勿充分融解。

4 比色:选择490nm波长,在醇联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

 

结果提供

整体实验报告,实验原始数据、图表,IC50值。


实验操作

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