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重庆医药研发





详细内容

CCK-8检测细胞活性

原理

Cell Counting Kit简称CCK试剂盒,是一种基于WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品,工作原理为:在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值,间接反映活细胞数量。

CCK法应用非常广泛,如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。


实验步骤

1 在96孔板中配制100μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在 37℃,5% CO2的条件下)。

2 向培养板加入10μL 不同浓度的待测物质。

3 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6、12、24或48小时)。

4 向每孔加10μL CCK8溶液(Engreen)。

5 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

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实验结果


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常见问题分析

1 实验操作注意事项有哪些?

答:注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数。


2 吸光度值过低是什么原因?

:细胞数量过低,增加待测细胞数量。染色难度大,延长CCK-8试剂的孵育时间。


3 CCK-8试剂盒检测细胞增殖和毒性的优点有哪些?

答:CCK-8较传统的MTT法优点在于:一是 MTT被线粒体内的一些脱氢还原酶还原成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解,而CCK-8产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤; 二是 CCK-8检测灵敏度更高,更加稳定; 三是酚红和血清对其测定无明显影响;四是不必去上清,不必洗,涤细胞,更加简便; 五是对细胞无明显毒性,加入显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,而且不影响细胞进行后续实验。

 

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