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Western Blot

蛋白质印迹(Western Blotting),是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品的某种蛋白表达情况的方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术。常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。博艾迈迪森生物为您提供专业的检测,保证实验结果的真实准确性。


实验流程图

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操作步骤

一 收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液,收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。


二 电泳(Electrophoresis) 

1 SDS-PAGE凝胶配制 

2 样品处理:在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。  100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。 

3 上样与电泳:冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了电泳方便起见,可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。


三 转膜(Transfer) 

选用PVDF膜,硝酸纤维素膜(NC膜)可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。


四 封闭(Blocking) 

转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。


五 一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。


六 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 

参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 


七 蛋白检测(Detection of proteins) 

洗片时使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机,可以自行配制显影液和定影液进行手工洗片。 


注意事项及常遇到的问题

1 分离胶不要倒的太满,需要有一定的浓缩胶空间,否则起不到浓缩效果。 

2 上样蛋白量不应超过30ug/mm2

3 gel通常在0.5-1h内凝集最好,过快表示TEMED、APS用量过多,此时胶太硬易龟裂,而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。

4 混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合,导致电泳带畸形。太慢不均匀,特别是甘油。    

5 电泳中常出现的一些现象: 

︶ 条带呈笑脸状,原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好。 

︵ 条带呈皱眉状,可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。 

拖尾:样品溶解不好。 

纹理(纵向条纹):样品中含有不溶性颗粒。 

条带偏斜:电极不平衡或者加样位置偏斜。 

条带两边扩散:加样量过多。


成果展示:

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