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免疫共沉淀(Co-IP)

免疫共沉淀(Co-IP)检测以抗体和抗原之间的专一性作用为基础,是用于研究蛋白质相互作用的经典方法。Co-IP检测到两种蛋白的结合,符合体内实际情况,检测结果可信度高,常用于验证两种已知蛋白的相互作用,以及寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

抗体结合于琼脂糖磁珠上的Protein A/G,当抗体免疫沉淀抗原蛋白时,能与抗原蛋白结合的目的蛋白一并被沉淀下来,形成“目标蛋白+抗原蛋白+抗体+Protein A/G”免疫复合物,经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。


实验过程

1 提取蛋白。

2 在细胞裂解液中加入抗X的抗体。

3 孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)。若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成复合物:“Y—X—抗X抗体—Protein A或G"

4 经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。(xy抗原、x抗体)。

5 western blot分析,质谱分析。

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实验的关键

1 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。

2 为防止蛋白的分解、修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。

3 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

4 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。


注意事项

细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的。

2 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用。

3 使用对照抗体。


平台优势

1 成功率高:使用进口试剂盒进行实验,PrpteinA碰珠吸附效高,实验成功率90%以上。

2 灵敏度高:采用银染技术,条带更清晰,实验结果更可靠。

3 准确率高:成熟的实验机制,科学的对照组设置,最大程度保证实验结果。

4 一站式服务:立体化的上下游服务体系,完善的基因、蛋白和抗体服务平台。



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