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细胞实验 7种细胞凋亡有效的检测方法

细胞实验 7种细胞凋亡有效的检测方法

  一、细胞凋亡的形态学检测?


  根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。


  1 光学显微镜和倒置显微镜


  2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜


  3 透射电子显微镜观察


  二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)


  磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。


  碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。


  注意事项


  1、整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。


  2、 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。


  Abbkine的Annexin V细胞凋亡检测试剂盒含有Abbkine专有的AbFluor?染料标记的Annexin V,可通过流式细胞仪或荧光显微镜对凋亡细胞进行鉴定和定量。同时使用AbFluorTM染料和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色可以区分完整细胞,早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞。


  三、线粒体膜势能的检测?


  线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。


  线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。


  注意事项


  1、保持平衡染液中pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。


  2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假去极化。


  四、DNA片断化检测?


  细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。


  1.大分子染色体DNA片段的测定


  2.DNA Ladder 测定


  3.凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析


  五、TUNEL法?


  细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。


  六、Caspase-3活性的检测?


  Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。


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