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重庆医药研发
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慢病毒包装 DC细胞培养

慢病毒包装 DC细胞培养

  一、试剂耗材:


  小鼠(8-10周龄)、玻璃皿(用于解剖小鼠)、培养皿(塑料,DC在光滑的皿里转化的好,因此最好使用一次性的塑料培养皿)、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管(50ml、100ml用饭盒多装一些)、锡箔纸、1ml注射器。


  重庆细胞因子:GM-CSF、IL-4


  重庆高压灭菌:除锡箔纸、注射器,其他物品都需要高压灭菌。


 

  二、实验步骤:


  1.取下小鼠的四肢(后两肢最好),分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤(用纱布反复的搓),完全暴露出骨及其附带关节,注意不要离断关节。将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨;


  2.用1ml注射器吸取GKN(1640也可以,但费用较高),冲洗骨髓至骨完全变白,吹入两个离心管,便于离心找平;


  3.1000转5分钟离心,倒掉上清液,再用1640悬起再离心一次,倒掉上清液;


  4.加细胞培养液,将骨髓细胞重悬,一只小鼠大概分4个培养皿,重悬的细胞总量尽量保持4ml;5.细胞至于培养皿,补充培养基。即1ml细胞+4ml培养液;


  6.加入细胞因子,IL-4和GM-CSF以向DC转化。用锡箔纸包裹,避光放入培养箱,轻拿轻放不可摇晃;


  7.第三天(之前不可拿出)等量加入培养基即4ml,并加入对应量的细胞因子。 8.第6~7天骨髓细胞中可转化为DCS(镜下)。


  三、注意事项:重庆


  细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯杀菌1h,操作前用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上口罩和帽子,操作时不能大声说话,双手戴上一次性橡胶手套,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。



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