慢病毒包装 DC细胞培养

慢病毒包装 DC细胞培养

　　一、试剂耗材：

　　小鼠（8-10周龄）、玻璃皿（用于解剖小鼠）、培养皿（塑料，DC在光滑的皿里转化的好，因此最好使用一次性的塑料培养皿）、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管（50ml、100ml用饭盒多装一些）、锡箔纸、1ml注射器。

　　重庆细胞因子：GM-CSF、IL-4

　　重庆高压灭菌：除锡箔纸、注射器，其他物品都需要高压灭菌。

　　二、实验步骤：

　　1．取下小鼠的四肢（后两肢最好），分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤（用纱布反复的搓），完全暴露出骨及其附带关节，注意不要离断关节。将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨；

　　2．用1ml注射器吸取GKN（1640也可以，但费用较高），冲洗骨髓至骨完全变白，吹入两个离心管，便于离心找平；

　　3．1000转5分钟离心，倒掉上清液，再用1640悬起再离心一次，倒掉上清液；

　　4.加细胞培养液，将骨髓细胞重悬，一只小鼠大概分4个培养皿，重悬的细胞总量尽量保持4ml；5．细胞至于培养皿，补充培养基。即1ml细胞+4ml培养液；

　　6．加入细胞因子，IL-4和GM-CSF以向DC转化。用锡箔纸包裹，避光放入培养箱，轻拿轻放不可摇晃；

　　7．第三天（之前不可拿出）等量加入培养基即4ml，并加入对应量的细胞因子。 8．第6~7天骨髓细胞中可转化为DCS（镜下）。

　　三、注意事项：重庆

　　细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯杀菌1h，操作前用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上口罩和帽子，操作时不能大声说话，双手戴上一次性橡胶手套，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。